Projets

COSETTE - COntribution des Substances Extracellulaires polymériques à la sTabilité sTructuralE des sols.

Les sols de la région Occitanie (dont notamment ceux des coteaux Gersois, Bigorre, Ariègeois, Lauragais, Castrais et Albigeois, ainsi que des versants des Pyrénées Orientales) sont particulièrement soumis à l’aléa d’érosion hydrique. En conséquence, cela impacte les services écosystémiques qu'ils peuvent fournir en termes de production agricole, de séquestration de carbone, de biodiversité, et de gestion de l’infiltration et de la qualité de l’eau.

Le travail de recherche porte sur l’étude des mécanismes de la formation des agrégats, ceux-ci étant essentiels pour limiter l’aléa érosion, favoriser la vie et le fonctionnement général des sols. Le projet consiste donc en une étude intégrée liant l’échelle microscopique des communautés microbiennes du sol, où se jouent les mécanismes, et l’échelle macroscopique des bassins versants et des paysages où se déterminent les flux et les conditions du milieu qui contrôlent les mécanismes.

Ce projet est développé au sein du Laboratoire de Biotechnologies Agroalimentaire et Environnementale (LBAE), du Centre de Recherche sur la Biodiversité et l'Environnement (CRBE) et du Centre d’Etudes Spatiales de la BIOsphère (CESBIO).

Travaux doctoraux du projet

Le projet s’appuie sur le bassin versant expérimental du Montoussé à Auradé (328 ha) intégré dans l’infrastructure OZCAR (https://bvea.sedoo.fr) et la Zone Atelier Pyrénées-Garonne (https://www.za-inee.org).

A l’échelle macroscopique (CRBE, CESBIO), l’objectif général est de mieux décrire le processus d’érosion en lien avec la stabilité structurale de sols argilo calcaires en poursuivant différents objectifs intermédiaires :

A l’échelle microscopique (LBAE), il s’agit de tester les hypothèses suivantes :

Financements 

BIO-STABLE - Bacterial Influence on Organic Soil Texture and Aggregation for Benefits Linked to Exopolymer production.

Le sol abrite une grande diversité de micro-organismes qui déterminent des fonctions clés dans les agrosystèmes. La composante bactérienne de ce microbiote du sol se trouve naturellement sous forme de biofilms, amas structurés de cellules englobées dans une matrice constituée de diverses substances exopolymériques (polysaccharides, ADN et protéines), regroupées sous le terme de Substances Extracellulaires Polymériques (EPS). Ces exopolymères jouent un rôle essentiel dans l'agrégation des particules du sol, tout particulièrement au niveau des micro-agrégats (< 250 µm), premiers échelons dans l’architecture du sol et contribuant ainsi à sa stabilité. En effet, ces biofilms vont améliorer la porosité et la capacité de rétention d'eau du sol tout en réduisant l'érosion. S’il est établi que des exopolysaccharides jouent un rôle déterminant dans la stabilisation des agrégats du sol, le rôle des protéines et de l’ADN extracellulaires est en revanche encore largement méconnu alors que ces composés sont décrits par ailleurs comme des éléments particulièrement impliqués dans la cohésion des biofilms.

Le projet vise à explorer comment les EPS sécrétées par les bactéries influencent la stabilité des sols, tout particulièrement dans le cas de contraintes hydriques et de variations de température. Les études seront menées à une échelle de sols simplifiés dans des conditions contrôlées de laboratoire (limitant de fait les très nombreuses interactions présentes dans un sol naturel, notamment avec les acides humiques), par inoculation de particules minérales de type argiles avec des cultures bactériennes productrices de différents types d’exopolymères. La caractérisation des agrégats formés sera réalisée par une combinaison d’approches physiques, biochimiques et microscopiques afin d’analyser de façon exhaustive les interactions du complexe particules minérales-bactéries/exopolymères.

Plus précisément, les souches bactériennes utilisées seront sélectionnées à partir de la collection de microorganismes du laboratoire parmi les genres Bacillus, Pseudomonas et Leuconostoc précédemment caractérisées pour leur capacité biofilmogène. Les expérimentations débuteront avec une souche de B. amyloliquefaciens et de L. mesenteroides qui ont fait l’objet d’études préalables (conditions de production d'EPS, type de polymères produits, génome séquencé, …). L’inoculation de particules minérales de sols de différents types d’argile avec des cultures bactériennes (souches seules ou sous forme de consortium) sera réalisée dans des conditions contrôlées permettant la formation de micro-agrégats. La caractérisation des agrégats sera réalisée de façon cinétique par une combinaison d’approches :

(1) Des analyses physiques pour évaluer la cohésion et la résistance à l’érosion par méthode normalisée;
(2) Des analyses biochimiques des EPS produits : extraction et dosages spectrophotométriques ou fluorométriques, spectroscopie infra-rouge, afin de caractériser et quantifier les différents types d’exopolymères produits;
(3) Des analyses microscopiques optique et électronique à balayage (MEB) permettant de visualiser l’architecture globale des agrégats. L’utilisation de la microscopie confocale ou à épifluorescence sera également envisagée afin d’observer plus finement l'interaction du complexe bactérie/EPS avec les particules de sol. La construction de souches bactériennes disposant de fusion GFP est également envisagée.

A terme, cette approche fonctionnelle, basée sur l’étude des produits du métabolisme microbien, permettra d’analyser plus finement l’impact des communautés microbiennes sur la stabilité des sols, et ouvre des perspectives prometteuses pour le développement de pratiques agricoles durables et la conservation des sols.

Dans un contexte environnemental fortement marqué par des tensions sur la ressource en eau et un déséquilibre inquiétant entre la demande et la disponibilité de cette ressource, la question de la gestion de l’eau et des efforts, innovations et principes à définir pour l’avenir se pose. La gestion des effluents aqueux et les économies d’eau dans un contexte d’économie circulaire, sont des solutions retenues par l’Etat français. Celui-ci vient récemment de modifier par décret l’article R. 211-23 du code de l’environnement, par ce qui concerne les usages et conditions de réutilisation des eaux usées traitées (REUT) notamment pour l’irrigation des cultures et la production de denrées alimentaires. Il est ainsi précisé que les eaux usées traitées autorisées au réemploi et leur usage doivent être compatibles avec les exigences de protection de la santé humaine et de l’environnement. La gestion des risques sanitaires et environnementaux est de fait la pierre angulaire de la REUT afin de sécuriser l’ensemble de ces usages potentiels.

Dans ce sens, un plan d’action pour une gestion résiliente et concertée de l’eau (Plan eau) est proposé par l’Etat français sur la base de 53 mesures visant à renforcer la sobriété des usages, la qualité et la disponibilité de la ressource. Des mesures de valorisation des eaux non conventionnelles, en particulier des eaux de pluie et des eaux grises, sont ainsi planifiées pour 2024 avec l’appui des agences de l’eau. Plus récemment le Décret no 2023-835 du 29 août 2023 relatif aux usages et aux conditions d’utilisation des eaux de pluie et des eaux usées traitées vient de préciser l’encadrement de ces pratiques pour les eaux usées. L’arrêté du 18 décembre 2023 relatif aux conditions de production et d'utilisation des eaux usées traitées pour l'irrigation de cultures donne de nouvelles grandes lignes afin de favoriser l’implantation de projets de REUT sur le territoire, ouvrant la porte à un champ d’investigation important.

Concernant ses ressources en eau, le département du Gers, département rural et agricole, est essentiellement affecté par un régime de précipitations changeant. Également porteur d’une filière agroalimentaire importante et reconnue, ce territoire apparaît donc comme un terrain expérimental pertinent de la REUT. Le cadre légal de la REUT sera élargi à la notion de REUSE telle que définie par le défi clef Water Occitanie qui ne s’interdit pas de proposer des pistes d’innovation proposant une analyse critique du cadre législatif actuel.

Dans ce contexte, nous avons notamment identifié les différents gisements de récupération de ces eaux alternatives et caractérisé la qualité de ces eaux  en termes de qualité sanitaire et environnementale. Cette étude a permis de montrer que la qualité physico-chimique de ces eaux était assez stable alors que la qualité microbiologique était sujette à une variabilité importante qu’il convient d’essayer de contrôler.

En savoir plus sur le Living Lab du défi clé eau Water Occitanie 

HYDREXSOL - Implication des substances EXopolymériques bactériennes dans la stabilité des SOLs en lien avec l'état HYDRique. 

Depuis quelques années, la recherche s’intéresse aux capacités des substances extracellulaires polymériques (EPS) bactériennes à stabiliser la structure des micro-agrégats de sol. Bacillus amyloliquefaciens, une rhizobactérie présentant de nombreuses potentialités agronomiques grâce à sa production d’EPS, a été choisie pour l’étude de biofilms modèles en vue d’une application future aux sols.

Dans un premier temps, ce travail a été consacré à la caractérisation des biofilms à l’interface air-liquide (pellicules) produits par la souche L-17 de B. amyloliquefaciens. La capacité naturelle de L-17 à présenter deux morphotypes a été l’opportunité de mettre en relation des propriétés physico-chimiques et biochimiques de biofilms variés produits par une souche unique. Un premier morphotype rugueux (R) sur gélose a formé en milieu liquide une pellicule épaisse, homogène et rigide et à la mouillabilité très réduite, en 72 h. Un second morphotype lisse (S) sur gélose a mis 96 h à former en milieu liquide une pellicule fine, hétérogène et élastique, et dont la mouillabilité était plus importante que pour R. L’empreinte biochimique par spectroscopie infra-rouge à transformée de Fourier a permis de mettre une évidence une production significativement supérieure de polysaccharides chez R, à l’interface entre le biofilm et le milieu de culture. L’imagerie des pellicules par microscopie confocale a permis d’identifier des polymères de type cellulose-like à cette interface chez R, alors que des fibres d’ADNe ont été détectées à l’intérieur du biofilm chez S.

Par la suite, la transposabilité des méthodes utilisées précédemment a été testée sur les EPS-like présentes dans le sol. Cela a permis de mettre en lumière les nombreuses limites qui existent encore à ce jour lorsqu’il s’agit d’analyser la matière organique du sol. En effet, la présence de substances humiques-like (SHL) colorées pose notamment problème en créant des interférences dans les techniques de colorimétrie ou de fluorimétrie. Une approche mathématique par régression linéaire multiple a été proposée pour prendre en compte la coloration de ces substances dans les dosages. Pour la quantification des protéines, l’utilisation de la spectroscopie de fluorescence 3D a été explorée, une méthode jusqu’alors utilisée sur des échantillons d’eaux peu chargés en matière organique. Le passage par des étapes supplémentaires d’extraction serait nécessaire pour différencier les signaux EPS-like des SHL.

Ce travail interdisciplinaire a permis de mieux relier composition, structure et propriétés du biofilm. De plus, il a mis en lumière la difficulté à quantifier les EPS des sols, ce qui freine notre compréhension de leurs rôles dans la stabilité des agrégats du sol.

Financements 

Les granules aérobies épuratifs sont des biofilms sphériques et denses, composés de bactéries entourées par une matrice de substances extracellulaires polymériques (EPS). L'utilisation de ces biofilms pour le traitement des eaux usées est en plein essor en raison de leur efficacité à traiter les polluants tout en étant plus compacts et moins consommateurs en énergie que les procédés à boues activées. Leur valorisation à travers l'extraction de différents sous-produits à haute valeur ajoutée représente un enjeu économique et sociétal pour les années à venir. La production de biopolymères gélifiants récupérés à partir des EPS de la matrice granulaire est une voie prometteuse qui a été étudiée dans ce travail de thèse. Les EPS sont biochimiquement très diversifiés car composés d'un mélange de polysaccharides, de protéines, de lipides, d'acides humiques et d'ADN. Ils jouent un rôle important dans la structuration du biofilm granulaire et contribuent de façon essentielle au caractère dense et très cohésif de la matrice extracellulaire. De ce fait, la méthode d'extraction des EPS gélifiants qui a été adoptée repose sur une solubilisation alcaline à température élevée suivie d'une étape de précipitation acide. Les effets des solvants et des températures de chauffage sur la récupération et les propriétés des EPS gélifiants ont été étudiés. L'hydroxyde de sodium a permis une meilleure solubilisation des EPS par rapport au carbonate de sodium mais la capacité à précipiter les EPS gélifiant à pH acide était plus élevée dans le carbonate de sodium. L'augmentation de la température a permis un meilleur rendement de solubilisation des EPS mais la dégradation des polymères dans l'hydroxyde de sodium a été mise en évidence, ce qui a orienté le choix vers le carbonate de sodium. Diverses stratégies expérimentales ont ensuite été développées (i) une méthode miniaturisée capable de détecter la gélification induite par le calcium et (ii) le fractionnement des molécules extraites par voie alcaline et précipitation acide. La méthode miniaturisée utilisant seulement 1 à 3 mg d'échantillon pour évaluer la capacité de gélification a été mise au point sur des molécules modèles pures ou en mélange, telles que l'alginate, l'albumine de sérum bovin et l'ADN. La méthode a consisté à calculer un pourcentage de réactivité à travers les spectres UV-vis et à déterminer le pourcentage de volume de gel formé après l'ajout de calcium. Les deux facteurs ont été combinés pour donner un facteur de gélification permettant de classer les solutions selon leur capacité de gélification. Les EPS extraits par voie alcaline et précipitation acide ont été fractionnés en fonction de leur charge à l'aide d'une colonne de chromatographie d'échange d'anions préparative. Le GF a été déterminé pour chaque fraction éluée et il a été montré que le GF des EPS anioniques adsorbés était corrélé avec leur charge négative. La distribution en taille des molécules présentes au sein des fractions et participant à la gélification a été analysée par chromatographie d'exclusion stérique : la majorité des hauts poids moléculaires détectés participent à la gélification alors que la participation des bas poids moléculaires est limitée. Enfin, il a été montré que même après fractionnement, les molécules anioniques participant à la gélification restent biochimiquement diversifiées et que les gels formés par les EPS isolés des granules sont des hydrogels fortement composites.

Dans le but de valoriser les EPS gélifiants, les résultats obtenus ont souligné la nécessité de moduler les méthodes d'extraction et de fractionnement vers la sélection de molécules ayant la charge négative appropriée et également vers la préservation de leur poids moléculaire lors des étapes d'extraction.
 

Financements 
 

SEPSOL - Stabilité structurale des SOLs et conséquences sur les émissions de gaz à effets de serre à l'échelle parcellaire - effets sur les Substances ExoPolymériques d'origine bactérienne.

Le maintien ou la restauration de la structure des sols, et la formation d’agrégats, constituent un levier d’actions efficaces pour améliorer la circulation de l’eau et des gaz dans la matrice poreuse des sols. Cette ambition répond aux enjeux relatifs à la séquestration du carbone dans les sols, à la modération des flux de GES, à la maîtrise de l’érosion et de l’hydromorphie. Il est désormais clairement établi que la matière organique, et en particulier les substances exopolymériques (EPS), joue un rôle prépondérant dans l’agrégation des sols. Dès 1982, un lien entre production d’exopolysaccharides et stabilité des agrégats a été établi. Depuis, de nombreux travaux ont été menés pour documenter les interactions entre les polysaccharides et les particules minérales du sol.

En influençant les propriétés physiques des sols, les communautés microbiennes influencent également l’habitat dans lequel elles évoluent et modifient les conditions de circulation d’eau et de gaz à l’intérieur des sols et à l’interface agrégats/macropores. Cela permet la formation de micro-sites à l’intérieur desquels vont se produire des processus biogéochimiques émetteurs de GES, dans des proportions variables selon les faciès microbiens qui auront été favorisés.

A l’échelle macroscopique, l’agrégation des sols se traduit par une plus forte stabilité vis à vis des forces de cisaillement et une meilleure circulation de l’eau et des gaz dans le domaine macroporal. Les réponses du système, à ces échelles, peuvent être appréhendées au travers d’indicateurs plus intégrés dérivant de la télédétection spatiale, de l’hydrologie (intégration spatiale) et de la biogéochimie (intégration temporelle). Il existe donc un enjeu fort de mener des études intégrées liant l’échelle microscopique des communautés microbiennes du sol, où se jouent les mécanismes, et l’échelle macroscopique des bassins versants et des paysages où se déterminent les flux et les conditions du milieu qui contrôlent les mécanismes.

Ce projet s’est focalisé sur les paysages molassiques des coteaux de Gascogne, dont les sols sont soumis à une érosion intense, en raison de la pression exercée par les pratiques agricoles et d’un contexte géomorphologique rendant le milieu particulièrement vulnérable. Par ailleurs, les rotations de cultures pratiquées amènent de longues périodes d’interculture pendant lesquelles une part importante des sols n’est pas couverte et se retrouve donc exposée aux pressions exercées par les aléas climatiques. Le recul de l’élevage dans le secteur au cours des 70 dernières années a eu pour conséquence de réduire fortement les apports d’amendement organique et la teneur en matière organique des sols. La structure des sols s’est ainsi progressivement dégradée, ce qui accroît la vulnérabilité des sols à l’érosion et entrave la vitesse de circulation de l’eau et la diffusion de gaz dans la matrice poreuse. Or les unités de sol présentent des propriétés contrastées, du fait des hétérogénéités du substratum molassique, et certaines surfaces durablement saturées en eau, résultant de ces hétérogénéités, constituent potentiellement des hot spots biogéochimiques avec émission exacerbée de N2O, CH4 et CO2.
 

Le projet a donc visé à documenter l’effet des EPS produits par certaines communautés microbiennes du sol sur la stabilité structurale des agrégats et, par extension, sur les émissions de GES, avec un focus spécifique sur les flux de N2O. Quatre hypothèses ont été testées :

(1) La production d'EPS par certains microorganismes du sol modifie les propriétés physiques des sols et plus particulièrement la stabilité structurale des agrégats;
(2) L’amélioration de la structure des sols est un levier majeur de modération des flux de GES;
(3) Les émissions de N2O se concentrent sur des points chauds biogéochimiques qui résultent de conditions hydromorphes;
(4) Les points chauds biogéochimiques peuvent être identifiés en combinant imagerie satellite, imagerie drone et modèle numérique de terrain finement résolu.